Sterile Verbindungen

Die infektionsfreie Verbindung zweier steriler Räume ist in vielen biochemischen Prozessen eine essentiell wichtige Funktionalität und manchmal auch eine anspruchsvolle Herausforderung sowohl an die Technik wie auch an den Betreiber der Anlage.

Oft geht es dabei um den Anschluss von Vorratsbehältern für Wachstums-Medien oder Korrekturmittel oder auch von Ernte- und Probenahmebehältern an einen Bioreaktor. Sind beide Behältnisse – z.B. eben der Reaktor und ein Medienbehälter - steril oder zumindest nur mit den gewünschten Organismen besetzt, besteht die Herausforderung darin, bei der Verbindung absolut zu verhindern, dass Fremdkeime von einem Behälter in den anderen oder von der Umgebung in einen der Behälter gelangen.
Welche technischen Möglichkeiten stehen nun zur Verfügung, eine solche Verbindung zweier steriler Räume infektionsfrei zu erstellen?

Das Anstechnadel-Membran System


Über einen Schlauch ist eine Nadel mit dem Behälter verbunden, der infektionsfrei an - z.B. - einen Fermenter angeschlossen werden soll. Die Nadel wird mit einer Schutzhülse (Sterilhülse) vor Kontamination durch Fremdkeime geschützt. Die ganze Einheit, Nadel mit Schutzhülse, Schlauch und Behälter, wird sterilisiert. An der Fermenteraussenwand, üblicherweise auf dem Deckel, steht ein mit der Nadel kompatibler Anschlussstutzen zur Verfügung, der mit einer geeigneten Kunststoffmembran, geschützt durch einen Blindstopfen, gegen die Umgebung geschlossen ist. Der Fermenter ist ebenfalls steril, oder gegebenenfalls schon mit einer Kultur angeimpft.

Um nun die beiden Einheiten, Behälter und Fermenter, miteinander infektionsfrei zu verbinden, wird die Nadel durch die Membran gestochen und über ein Gewinde am Fermenterstutzen befestigt. Unmittelbar zuvor werden Sterilhülse und Blindstopfen entfernt. Um das Risiko einer Infektion weiter zu vermindern, wird der Anstechvorgang entweder unter steriler Atmosphäre (z.B. einem Laminar-Flow-System) durchgeführt oder es wird Ethanol auf der Membrane vorgelegt, bevor die Nadel durch die Membrane gestochen wird. Wird das Ethanol vorgängig entzündet, kann die Sterilhülse direkt über der Flamme von der Nadel entfernt und die Nadel durch Flamme und Membran gestochen werden.

Die Methode zeichnet sich durch einfache, wartungsarme und kostengünstige Technik aus. Eine infektionsfreie Verbindung kann damit auch während einer Kultivation durchgeführt werden. Allerdings setzt die sichere, absolut infektionsfreie Herstellung einer Verbindung ein gewisses Maß an Übung und Erfahrung des Bedienpersonals voraus. Die Methode ist weit verbreitet, insbesondere im Forschungs- und Entwicklungsbereich.

SteriCap Anschluss-System


Das SteriCap-Ventil ist über einen Schlauch mit dem Behälter verbunden, der infektionsfrei z.B. an einen Fermenter angeschlossen werden soll. Das SteriCap-Ventil wird in geschlossener Stellung zusammen mit Schlauch und Behälter im Autoklaven sterilisiert. An der Fermenteraussenwand, üblicherweise auf dem Deckel, steht ein mit dem SteriCap-Ventil kompatibler Anschlussstutzen zur Verfügung. Über einen solchen Stutzen wird das geschlossene SteriCap mit dem Fermenter verbunden. Der Fermenter ist zu diesem Zeitpunkt noch nicht zwingend steril und es befindet sich noch keine Kultur im Fermenter.

Ist das SteriCap, immer noch in geschlossener Stellung, mit dem Fermenter verbunden, wird der Fermenter sterilisiert und damit auch die sich im Stutzen befindliche Aussenfläche des SteriCap-Ventils. Jetzt kann das Ventil geöffnet werden, eine Kontamination des Fermenters oder des angeschlossenen Behälters mit Fremdkeimen ist nicht mehr möglich.

Mit dem SteriCap lässt sich ohne Gefahr von Fehlmanipulationen, mit einfachen Handgriffen eine infektionsfreie Verbindung herstellen. Das SteriCap-System erfüllt die Anforderungen von GMP. Es ist kostengünstig, da es wie auch die Anstechnadeln keine eigenen Dampf- und Kondensatleitungen benötigt, und es beansprucht wenig Platz am Fermenterkessel.

Im Gegensatz zum Membran-Anstechnadel-System oder z.B. dampfsterilisierbaren Sterilkreuzen lassen sich mit dem SteriCap-System keine weiteren sterilen Verbindungen während einer laufenden Kultivierung herstellen. Alle notwendigen sterilen Verbindungen müssen vor der Kesselsterilisation erstellt werden, eine vorausschauende Planung des Fermentationsprozesses ist daher wichtig.

Im Gegensatz zu den anderen beschriebenen Systemen ist das SteriCap-System nicht geeignet für den Anschluss von Behältern mit Inokulum-Kulturen. Denn Kulturen müssten während der ganzen Dauer der Fermenter-Sterilisation unter nicht idealen Bedingungen, d.h. kaum gerührt, temperiert oder belüftet, neben dem Fermenter positioniert werden. Erst nachdem der Fermenter genügend abgekühlt ist könnte das Inokulum transferiert werden. Deshalb sind für den Anschluss von Inokulumbehältern andere Systeme, z. B das unten beschriebene Einspritzventil oder Sterilkreuz wesentlich besser geeignet. Bei diesen Systemen muss die Inokulum-Kultur nur kurze Zeit dem Fermenter beigestellt werden, bis die Flüssigkeit infektionsfrei transferiert werden kann.

Einspritzventil


Der Behälter, der infektionsfrei an einen Fermenter z.B. angeschlossen werden soll, ist über einen Schlauch mit einem manuell bedienbaren Membranventil verbunden, dessen Membran die Sterilgrenze bildet. Dieses Ventil, wir nennen es auch „Dampfsterilisierbare Schnellkupplung“, wird in geschlossener Stellung zusammen mit Schlauch und Behälter sterilisiert. An der Fermenteraussenwand, üblicherweise im oberen, zylindrischen Teil des Kessels, ist ein manuell bedienbares Einspritzventil angebracht, das direkt an der Kesselwand schließt, also gegen den Kessel keinen Totraum bildet. An dieses Einspritzventil wird das geschlossene, zusammen mit Schlauch und Behälter im Autoklaven vorsterilisierte Membranventil angeschlossen. Über einen Dampfanschluss am Membranventil und einen Anschluss für Kondensatabfluss am Einspritzventil wird nun der Zwischenraum zwischen den beiden geschlossenen Ventilen mit Dampf sterilisiert. Danach können die beiden Ventile geöffnet werden und der Flüssigkeitstransfer sicher und einfach ohne jede Infektionsgefahr vollzogen werden.

Diese Verbindung kann jederzeit neu erstellt und sterilisiert werden, auch während einer laufenden Kultivierung.
Über das Einspritzventil können auch größere, in situ sterilisierbare Behälter über ihr Bodenablassventil mit einem in situ sterilisierbaren Fermenter oder anderem Behälter verbunden werden.
Mit dem Einspritzventil in Kombination mit der dampfsterilisierbaren Schnellkupplung lässt sich ohne Gefahr von Fehlmanipulationen eine infektionsfreie Verbindung herstellen. Die Anforderungen von GMP werden dabei selbstverständlich vollumfänglich erfüllt. Die Verbindung kann zudem auch in situ gereinigt werden (CIP-fähig) und hat den spezifischen Vorteil, dass bei geschlossenen Einspritzventil aufgrund der Totraumfreiheit kein zusätzliches Ventil für die Kondensatabführung bedient werden muss. Das System eignet sich deshalb besonders für kostengünstige halbautomatische Fermentersysteme, bei denen zwar die Sterilisation des Fermenterkessels automatisiert ist, auf die Automatisierung von Zusatzfunktionen aber verzichtet wird.

Sterilkreuz


Auch bei dieser Lösung ist ein Behälter, der infektionsfrei z.B. an einen Fermenter angeschlossen werden soll, über einen Schlauch mit einer manuell bedienbaren dampfsterilisierbaren Schnellkupplung (Membranventil) verbunden. An der Fermenteraussenwand ist über ein Rohr ein Membranventil angebracht, das den Kessel gegenüber der Umgebung abgrenzt. An dieses Membranventil wird die zusammen mit Schlauch und Behälter im Autoklaven vorsterilisierte Schnellkupplung angeschlossen. Über einen Dampfanschluss am einen Membranventil und einen Anschluss für Kondensatabfluss am anderen, fermenterseitigen Membranventil wird der Zwischenraum zwischen den beiden geschlossenen Ventilen mit Dampf sterilisiert. Danach können die beiden Ventile geöffnet werden und der Transfer der Flüssigkeit sicher und einfach ohne jede Infektionsgefahr vollzogen werden. Da Dampfzufuhr und Kondensatabgang ebenfalls mittels Membranventilen geschlossen oder geöffnet werden, ergibt sich eine Gruppe von vier Ventilen, die ähnlich einem Kreuz angeordnet sein können - deshalb die Bezeichnung Sterilkreuz.

Diese Verbindung kann wie bei der Einspritzventil-Lösung jederzeit neu erstellt und sterilisiert werden, auch während einer laufenden Kultivierung. Sie ist ebenfalls einfach, sicher, infektionsfrei und GMP-konform herzustellen. In situ Reinigung (CIP) ist selbstverständlich möglich.

Dazu kann das Sterilkreuz auch voll automatisiert werden und es lässt sich im Gegensatz zu den anderen Lösungen auch mit grossen Leitungsdurchmessern und entsprechenden Ventilen realisieren. Damit können über ein Sterilkreuz Medien auch mit hohen Flussraten transferiert werden.

Für die sichere, infektionsfreie Verbindung zweier steriler Räume stehen also viele Lösungen zur Verfügung, die je nach Situation alle ihre spezifischen Vor- und Nachteile haben. Bioengineering AG unterstützt gerne dabei, die für das Gesamtsystem jeweils beste Lösung zu wählen.

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